蛋白質(zhì)純化

RP-HPLC 是一種有效的蛋白質(zhì)/多肽純化工具。
通過 RP-HPLC 法可以從雜質(zhì)中分離目標(biāo)蛋白/多肽，采集到的片段可用于進一步研究，以及借助正交分析技術(shù)的分析，甚至可作為治療藥物。

在蛋白質(zhì)/多肽分析過程中，色譜條件優(yōu)化的目標(biāo)是優(yōu)化分辨率和保留時間。
制備色譜法分離蛋白質(zhì)/多肽時，色譜條件的開發(fā)主要是三個參數(shù)的優(yōu)化（參見圖45）：

• 產(chǎn)量是從色譜法每一步中得到的純化的目標(biāo)蛋白/多肽含量。高產(chǎn)量可提高純化過程的實用性，并降低成本。
• 純度是從目標(biāo)產(chǎn)物中去除雜質(zhì)的程度。純度高有助于從后續(xù)分析中獲得更佳的數(shù)據(jù)或獲得高純度產(chǎn)物。
• 通量用來衡量制備周期中純化的物質(zhì)量。高通量說明在給定的成本和時間內(nèi)獲得更多研究或分析用物質(zhì)，或更多原料藥，用于制藥領(lǐng)域。

由于制備色譜的目的與分析色譜的目的不同，因此色譜條件優(yōu)化也不同。

圖45. 在蛋白質(zhì)或多肽的制備純化中，通過尋求產(chǎn)量、純度及通量的最佳平衡實現(xiàn)分離條件的優(yōu)化。

樣品裝載
在分析色譜中，將小樣品裝載到色譜柱上以確保加樣量不影響分辨率。
如果樣品量過高，則峰會加寬，進而分辨率會下降。
在不發(fā)生峰展寬的情況下允許加載到色譜柱的樣品量（“樣品容量”）取決于柱的大小（附錄列表顯示了柱的大小和樣品容量）。
制備色譜法純化蛋白質(zhì)/多肽時，通常會超出樣品容量，使柱“過載”，從而增加產(chǎn)量和通量（圖46）。
當(dāng)允許一定的分辨率損失時，加載的樣品量可為樣品容量的10~50倍（附錄，最大實際負(fù)載）。
圖46中，盡管由于柱過載使得峰變寬，但峰形相對較好，說明嚴(yán)重過載在增加產(chǎn)量的同時還能保持純度，但目標(biāo)蛋白/多肽的損失不可避免。
由于樣品過載，圖47中峰也同樣加寬。

片段收集、分析和利用
當(dāng)柱過載時，通常會拋棄起始峰和結(jié)尾峰。
圖46中，對紅色區(qū)標(biāo)示的峰的中間區(qū)域進行了收集。去掉了峰首和峰尾。
這避免了分離度較差的雜質(zhì)峰的收集，增加了純度，但降低了產(chǎn)量。
在制備色譜中，對幾種感興趣的峰進行了片段收集，用于雜質(zhì)分析。

圖46.在多肽純化示例中，制備分離包括柱的過載加樣，以增加產(chǎn)量。
分辨率降低，為了增加純度必須拋棄峰首和峰尾，但產(chǎn)量稍微有所降低。

基于分析結(jié)果，收集了少雜質(zhì)或無雜質(zhì)的片段，拋棄了峰首和峰尾附近雜質(zhì)較多的片段。
收集和拋棄片段的選擇應(yīng)考慮純度和產(chǎn)量的平衡。

例如，在不損失分辨率的情況下，4.6 x 250 mm的“分析”柱可用于純化少量多肽（最多約200微克）。
但為了增加產(chǎn)量和通量，同樣大小的柱最多可純化10毫克，但會有一定的純度或產(chǎn)量損失。
恰當(dāng)?shù)氖占暹x擇有助于實現(xiàn)純度和產(chǎn)量間的最佳平衡。

在制備色譜中，盡管重點在樣品質(zhì)量，但樣品體積也可能會很大。
盡管可采用樣品環(huán)和注射器，但通過將樣品“泵”至柱上可以注入更多樣品。
將泵的吸入管置于樣品容器內(nèi)，樣品通過洗脫泵加載至色譜柱。
當(dāng)有機溶劑濃度低（通常，樣品裝在水相中）且目的蛋白/多肽以有機溶劑梯度洗脫時，可通過這種方式裝入大量樣品。

吸附劑粒徑
分析色譜常用的吸附劑粒徑為5μm，制備色譜常用的吸附劑粒徑更大。
尤其是加樣量超過樣品容量時（柱過載），柱效較分析色譜影響較小。
當(dāng)柱過載時，大粒徑填充柱同小粒徑填充柱分離蛋白質(zhì)和多肽的效果一樣。
因此，制備色譜常用10μm或以上粒徑的吸附劑。粒徑分布也往往更寬。
不同于0.5μm或更窄的粒徑分布范圍，制備色譜的粒徑范圍更大，例如10~15μm。
由于制備色譜柱反壓和成本更低，因此更傾向于采用大粒子。

柱內(nèi)徑
由于樣品容量很低，純化過程很少使用小孔柱（內(nèi)徑小于2mm）。
小規(guī)模實驗室純化采用細(xì)孔柱（內(nèi)徑約2mm）和分析柱（4.6 mm內(nèi)徑）。
這種小規(guī)模制備分離的色譜條件通常與分析分離的色譜條件相同。
需要大量蛋白質(zhì)/多肽時，采用10mm和22mm內(nèi)徑的柱子。
1 mg蛋白質(zhì)或多肽的純化可采用10 mm柱子，5 mg純化可采用22 mm柱子。
允許柱過載時，可純化更多蛋白質(zhì)/多肽，10mm柱最多可純化50mg，22mm柱最多可純化200mg。
大量蛋白質(zhì)或多肽的純化采用50 mm、100 mm或內(nèi)徑更大的大內(nèi)徑柱子。
50mm內(nèi)徑的柱上已知最多可純化5克蛋白質(zhì)/多肽。

柱長
與分析柱相比，制備柱往往相對較短。
這是因為在制備色譜法中，柱的總體積比柱長更重要，特別是蛋白質(zhì)的分離。
內(nèi)徑60cm、柱長12-15 cm（“圓餅狀”柱）的色譜柱已應(yīng)用到蛋白質(zhì)治療藥物的大規(guī)模純化中。
由于在制備色譜法中，柱通常過載，且效益的重要性遠不及產(chǎn)量、純度及通量重要，因此根據(jù)其實用性而非效益優(yōu)化柱尺寸。

流動相組成
同分析色譜法一樣，采用10~22mm內(nèi)徑柱的小規(guī)模純化常用乙腈-TFA體系。
大規(guī)模純化通常采用乙醇等溶劑替代乙腈，采用乙酸替代TFA。
盡管采用這些溶劑作流動相會降低分辨率，但它們更適合大規(guī)模使用，且分辨率的降低與柱過載固有的分辨率損失相同

蛋白質(zhì)變性
通常認(rèn)為反相色譜法會使蛋白質(zhì)變性，因此洗脫出來的蛋白質(zhì)不是天然蛋白，且可能不具備生物活性。
盡管反相HPLC的操作條件會使蛋白質(zhì)變性，但洗脫后仍可獲得天然、具有生物活性的蛋白質(zhì)。
有機溶劑可能減弱疏水力，造成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的損失。吸附劑的疏水面也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的去折疊。
但與色譜分離時間相比，蛋白質(zhì)去折疊通常較慢，且蛋白質(zhì)在反相色譜分離期間僅發(fā)生輕微變性。
由于二硫鍵的作用，蛋白質(zhì)保持球形結(jié)構(gòu)，且僅發(fā)生部分去折疊，因此從反相柱洗脫出的蛋白質(zhì)通常可通過在恰當(dāng)?shù)闹卣郫B緩沖液中處理，從而恢復(fù)其天然結(jié)構(gòu)而恢復(fù)至天然狀態(tài)。
目前有許多實例均顯示采用反相HPLC純化后的蛋白仍維持天然三級結(jié)構(gòu)和生物活性。
胰蛋白酶的反相純化，其中活性得到了保留，且隨后用于蛋白質(zhì)的胰蛋白酶酶切。
重組人紅細(xì)胞生成素是一種成功商業(yè)化的蛋白質(zhì)治療藥物，采用了反相高效液相色譜法將蛋白藥物從其細(xì)胞培養(yǎng)表達系統(tǒng)中分離出來。
采用反相HPLC對另一種商業(yè)蛋白質(zhì)治療藥物——粒細(xì)胞刺激因子進行了純化。
此外，還采用反相HPLC對重組人胰島素進行了純化，維持了活性結(jié)構(gòu)。

純化實例
圖47顯示了合成肽——促性腺激素釋放激素（GnRH）拮抗劑的純化過程。該純化過程通過以下幾個步驟展開：

• 在4.6 x 250 mm 的分析柱上構(gòu)建洗脫條件。
• 在50 x 300 mm 的柱上裝載1.2克合成肽混合物，基于第一步構(gòu)建的條件洗脫（圖47）。
• 對 GnRH 拮抗劑各洗脫峰的片段進行收集并借助分析法分析，最終實現(xiàn)最高產(chǎn)量和純度。
• 用乙腈和TFA作為洗脫劑，在反相色譜柱上再次進行色譜分析,完成收集到片段的脫鹽處理。
• 收集片段實現(xiàn)最高產(chǎn)量和純度。
  

在該色譜純化步驟中，從1.2 gm的反應(yīng)混合液中可收集128 mg的純化肽。
該純化過程采用了與分析色譜分離相同的有機溶劑——乙腈，但采用磷酸三乙胺替代了TFA。
由于柱過載，洗脫峰更寬，分辨率不如分析色譜。但峰仍然較為緊密，且容易收集到含目的多肽和GnRH的洗脫液。

圖47. 128mg的合成肽——促性腺激素釋放激素的純化。

柱嚴(yán)重過載，導(dǎo)致峰非常寬。

條件

色譜柱：C18寬孔柱，15~20μm粒徑，50 x 300 mm。

流動相：乙腈和磷酸三乙胺水溶液梯度洗脫。

樣品：促性腺激素釋放激素